羊源性成分DNA SYBR Green Real Time PCR 检测试剂盒

羊源性成分DNA SYBR Green Real Time PCR 检测试剂盒

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制品内容（25μl反应×50次）

1.

2×Premix for PCR*1

900μl

2.

Primer Mix for Ovine*2

100μl

3.

20×SYBR Green I*3

50μl

4.

dH2O

1ml

5.

Control DNA for Ovine

50μl

 6．

50×ROX reference dye

25μl

*1  2×Premix for PCR中含有反应用dNTP、Buffer、Taq酶等。

*2  Primer Mix for Ovine中含有扩增用引物。

*3  20×SYBR Green I须避光保存；使用前在室温下平衡并彻底混匀。

 

保存：-20℃

 

制品说明

本制品是利用SYBR Green Real Time PCR技术快速检测羊（绵羊和山羊）基因组DNA的试剂盒。采用荧光PCR技术，
根据线粒体DNA上动物种间多样性的差异进行羊（绵羊和山羊）源性成分鉴定。SYBR Green染料是一种高灵敏的
DNA荧光染料,可以嵌合于DNA 双链结构的小沟中，其处于游离状态时, 检测不到荧光信号, 当结合dsDNA 后荧光强
度明显增强，荧光信号会增强800-1000倍, 即可被荧光探测系统检测到。制品中2×Premix for PCR已经将DNA聚合酶、
反应用Buffer、dNTP等试剂预混在一起。进行实验时，PCR反应液的配制十分简单。试剂盒使用了高成功率PCR酶与
精心研制的SYBR Green Real Time PCR用Buffer组合使用，具有优良的保真性，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，
可信度高，大大提高了PCR反应液的扩增效率。本检测灵敏度高、不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉，无需
电泳 ，安全可靠，简单快捷，特异性强。本制品适用于食品、化妆品和饲料等样品中羊（绵羊和山羊）源性成分的鉴别。

 

实验操作

1.  按下列组份配制PCR反应液。

2×Premix for PCR

18μl

Primer Mix for Ovine

2μl

20×SYBR Green I

1μl

样品DNA *

3.5μl

50×ROX reference dye

0.5μl

dH2O

up to 25μl

* Negative Control反应时，用dH2O替代样品DNA，Positive Control反应时，用Control DNA for Ovine替代样品DNA。

2.  按下列条件进行PCR反应：

①．Light Cycler(Roche Diagnostics)仪器

使用本仪器时不需加“50×ROX reference dye”。

Program

cycles

Temperature

 (℃)

Incubation

Time(min:sec)

Temperature

Transition  Rate

    (℃/sec)

Acquisition

Mode

Analysis

Mode

1

1

94

2:00

20

None

None

2

40

94

0:15

20

None

None

55

0:30

20

None

72

0:30

20

Single

    3

1

         95

0:10

20

None

Melting

Curve

50

0:10

20

None

95

0:00:00

0.1

Cont

4

1

40

0:10

20

None

None

 

②．ABI 7300/7500 Real-time PCR System ,7500 Fast Real-time PCR

94℃

 2 min

   

1Cycle

94℃

15  sec

    40 Cycles

55℃

30  sec

72℃

30  sec

                 

dissociation stage

95℃

15  sec

1Cycle

60℃

60  sec

95℃

15  sec

60℃

15  sec

注：以上操作设定前请选择染料为SYBR。                                         

质量控制

以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

a) 空白对照(Blank control)：未检出荧光信号。

b) 阴性对照(Negative control)：未检出荧光信号。

c) 阳性对照(Positive control)：检测出荧光信号，并呈现典型峰状曲线。

 

结果判定

①. 反应结束后，确认SYBR  Green I实时PCR扩增曲线和熔解曲线，结合CT(threshold cycle，阈循环)值、Tm(melting
temperature，熔解温度)值判定结果。样本的扩增CT值≤35且荧光曲线呈对数增长；Tm值在阳性对照的Tm±0.5℃
范围之内，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断样品检出羊（绵羊和山羊）源性成分，报告检出羊（绵羊和
山羊）源性成分。

②. 检测结果Ct≥40.0，Tm值在阳性对照的Tm±0.5℃范围之外，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品未检出羊
（绵羊和山羊）源性成分，报告未检出羊（绵羊和山羊）源性成分。