|
制品内容（25μl反应×50次）
|
1.
|
2×Premix for
PCR*1
|
900μl
|
|
2.
|
Primer Mix for
Anser*2
|
100μl
|
|
3.
|
20×SYBR Green
I*3
|
50μl
|
|
4.
|
dH2O
|
1ml
|
|
5.
|
Control DNA
for Anser
|
50μl
|
|
6．
|
50×ROX
reference dye
|
25μl
|
*1 2×Premix for PCR中含有反应用dNTP、Buffer、Taq酶等。
*2 Primer Mix for Anser中含有扩增用引物。
*3 20×SYBR Green I须避光保存；使用前在室温下平衡并彻底混匀。
保存：-20℃
制品说明
本制品是利用SYBR
Green Real Time PCR技术快速检测鹅基因组DNA的试剂盒。采用荧光PCR技术，根据线粒体
DNA上动物种间多样性的差异进行鹅源性成分鉴定。SYBR Green染料是一种高灵敏的DNA荧光染料,可以嵌合于
DNA 双链结构的小沟中，其处于游离状态时, 检测不到荧光信号, 当结合dsDNA 后荧光强度明显增强，荧光信
号会增强800-1000倍, 即可被荧光探测系统检测到。制品中2×Premix for PCR已经将DNA聚合酶、反应用Buffer、
dNTP等试剂预混在一起。进行实验时，PCR反应液的配制十分简单。试剂盒使用了高成功率PCR酶与精心研制的
SYBR Green Real Time PCR用Buffer组合使用，具有优良的保真性，可以有效抑制非特异性的PCR扩增，可信度
高，大大提高了PCR反应液的扩增效率。本检测灵敏度高、不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉，无需电泳
，安全可靠，简单快捷，特异性强。本制品适用于食品、化妆品和饲料等样品中鹅源性成分的鉴别。
实验操作
1. 按下列组份配制PCR反应液。
|
2×Premix for PCR
|
18μl
|
|
Primer Mix for
Anser
|
2μl
|
|
20×SYBR Green
I
|
1μl
|
|
样品DNA *
|
3.5μl
|
|
50×ROX
reference dye
|
0.5μl
|
|
dH2O
|
up to 25μl
|
* Negative
Control反应时，用dH2O替代样品DNA，Positive Control反应时，用Control DNA for Anser替代样品DNA。
2. 按下列条件进行PCR反应：
①．Light Cycler(Roche Diagnostics)仪器
使用本仪器时不需加“50×ROX reference dye”。
|
Program
|
cycles
|
Temperature
(℃)
|
Incubation
Time(min:sec)
|
Temperature
Transition
Rate
(℃/sec)
|
Acquisition
Mode
|
Analysis
Mode
|
|
1
|
1
|
94
|
2:00
|
20
|
None
|
None
|
|
2
|
40
|
94
|
0:15
|
20
|
None
|
None
|
|
55
|
0:30
|
20
|
None
|
|
72
|
0:30
|
20
|
Single
|
|
3
|
1
|
95
|
0:10
|
20
|
None
|
Melting
Curve
|
|
50
|
0:10
|
20
|
None
|
|
95
|
0:00:00
|
0.1
|
Cont
|
|
4
|
1
|
40
|
0:10
|
20
|
None
|
None
|
②．ABI 7300/7500 Real-time PCR System ,7500 Fast
Real-time PCR
|
94℃
|
2 min
|
|
1Cycle
|
|
94℃
|
15 sec
|
|
40 Cycles
|
|
55℃
|
30 sec
|
|
72℃
|
30 sec
|
dissociation
stage
|
95℃
|
15 sec
|
|
1Cycle
|
|
60℃
|
60 sec
|
|
95℃
|
15 sec
|
|
60℃
|
15 sec
|
注：以上操作设定前请选择染料为SYBR。
质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
a) 空白对照(Blank control)：未检出荧光信号。
b) 阴性对照(Negative control)：未检出荧光信号。
c) 阳性对照(Positive control)：检测出荧光信号，并呈现典型峰状曲线。
结果判定
①. 反应结束后，确认SYBR Green I实时PCR扩增曲线和熔解曲线，结合CT(threshold cycle，阈循环)值、Tm(melting
temperature，熔解温度)值判定结果。样本的扩增CT值≤35且荧光曲线呈对数增长；Tm值在阳性对照的Tm±0.5℃范
围之内，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断样品检出鹅源性成分，报告检出鹅源性成分。
②. 检测结果Ct≥40.0，Tm值在阳性对照的Tm±0.5℃范围之外，同时各种实验对照结果正常，可以判断样品未检出鹅源
性成分，报告未检出鹅源性成分。
|
